單細(xì)胞生物學(xué)近幾年是非常熱門的研究方向。在這一實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域中的則是單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)。傳統(tǒng)測(cè)序方法一次處理成千上萬個(gè)細(xì)胞，得到的變異水平也是成千上萬個(gè)細(xì)胞的平均后水平。但是，就如同世界上沒有完全相同的兩片樹葉一樣，沒有兩個(gè)細(xì)胞是完全相同的。所以，單細(xì)胞測(cè)序?qū)τ谘芯繂蝹€(gè)細(xì)胞就顯得至關(guān)重要。

     單細(xì)胞測(cè)序可以揭示出每個(gè)細(xì)胞獨(dú)特的微妙變化，甚至可以揭示全新的細(xì)胞類型。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可謂是科技發(fā)展史上的一大創(chuàng)舉，它推進(jìn)了基因組學(xué)領(lǐng)域，使不同細(xì)胞類型得以精細(xì)區(qū)分，使得科學(xué)家們?cè)趩渭?xì)胞水平進(jìn)行分子機(jī)制研究成為可能。

      隨著高通量RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，2009年，開發(fā)了一個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)。到了2011年Nicholas等人開發(fā)了單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)。2013年又開發(fā)出了單細(xì)胞全基因組DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)。隨后，科學(xué)家在細(xì)胞分選技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、信噪比提高方面等進(jìn)行不斷優(yōu)化和改進(jìn)，也進(jìn)一步開創(chuàng)了單細(xì)胞Hi-C、單細(xì)胞ChIP-seq、單細(xì)胞ATAC-seq技術(shù)等。

      2017年單細(xì)胞測(cè)序在技術(shù)水平和應(yīng)用層面上都更進(jìn)一步發(fā)展，本周我們匯總了2017年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)層面的部分重要進(jìn)展。

SCI-seq

     2017年3月，美國俄勒岡的研究人員在Nature Methods上發(fā)表“Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing (doi:10.1038/nmeth.4154) ”文章，開發(fā)出一種SCI-seq (single-cell combinatorial indexed sequencing，單細(xì)胞組合標(biāo)記測(cè)序技術(shù))，多次對(duì)細(xì)胞進(jìn)行條形碼編碼標(biāo)記后對(duì)它們進(jìn)行測(cè)序，可以同時(shí)構(gòu)建上千個(gè)單細(xì)胞文庫，檢測(cè)體細(xì)胞拷貝數(shù)的變異。這項(xiàng)技術(shù)縮減了文庫構(gòu)建的成本，增加了檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)量，這對(duì)于體細(xì)胞變異的檢測(cè)，尤其是在腫瘤進(jìn)化過程中對(duì)細(xì)胞亞克隆變異研究具有重要價(jià)值。研究人員從培養(yǎng)的細(xì)胞系、靈長類額葉皮層組織和兩個(gè)人類胰腺癌中構(gòu)建了大約17000個(gè)單細(xì)胞基因組文庫，這大約比利用常規(guī)方法能夠構(gòu)建出的基因組文庫大小高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)。 

      2017年4月北京大學(xué)謝曉亮教授團(tuán)隊(duì)在Science上發(fā)表“Single-Cell Whole Genome Analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI) (doi: 10.1126/science.aak9787)”文章，開發(fā)一種新型的單細(xì)胞全基因組線性擴(kuò)增的方法——;LIANTI（Linear Amplification with Transposon Insertion）用于單細(xì)胞全基因組測(cè)序。

      LIANTI法通過轉(zhuǎn)座子插入進(jìn)行線性放大?；蚪M被含有T7啟動(dòng)子的Tn5轉(zhuǎn)座子隨機(jī)片段化 ，T7啟動(dòng)子允許線性擴(kuò)增。LIANTI法測(cè)量拷貝數(shù)的空間分辨率提高了３個(gè)數(shù)量級(jí)（能在千堿基分辨率進(jìn)行微小CNV檢測(cè)，基因組覆蓋率可達(dá)到97%)，能直接觀察從細(xì)胞到細(xì)胞不同的隨機(jī)發(fā)生的DNA復(fù)制起始位點(diǎn)。他們用新方法檢測(cè)了被紫外線照射過的單個(gè)人類細(xì)胞的單核苷酸突變，結(jié)果明顯優(yōu)于目前已知的其他方法。這意味LIANTI能更有效、準(zhǔn)確地檢測(cè)出更多疾病突變。
 

CROP-seq

     2017年7月，奧地利研究人員在Nature Methods上發(fā)表“Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout (doi:10.1038/ nmeth.4227)”文章，創(chuàng)造性地將CRISPR-Cas9和單細(xì)胞RNA測(cè)序兩種較有前景的基因組學(xué)領(lǐng)域結(jié)合在一起，發(fā)明了這種被稱作CROP-seq的單細(xì)胞測(cè)序方法 (CRISPR droplet sequencing， CRISPR液滴測(cè)序), 能大規(guī)模完成的高通量基因調(diào)控的分析。

     團(tuán)隊(duì)首先結(jié)合了CRISPR集中篩選和按序篩選的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建出一種能夠幫助研究人員看到單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)的CRISPR gRNAs的病毒載體， 再結(jié)合新的用于單細(xì)胞RNA測(cè)序的液滴方法足以高通量地分析單個(gè)細(xì)胞中上千種基因組編輯事件的影響。隨著單細(xì)胞測(cè)序成本的下降，這種方法能夠產(chǎn)生首批人類基因組上2.3萬個(gè)基因中每個(gè)基因的調(diào)節(jié)影響的綜合圖譜。
   

scCOOL-seq

2017年8月，北京大學(xué)湯富酬教授團(tuán)隊(duì)在Cell Research 上發(fā)表 “Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells (doi: 10.1038/cr.2017.82)”文章，開發(fā)了一種單細(xì)胞多重測(cè)序技術(shù) (scCOOL-seq)，可以對(duì)一個(gè)單細(xì)胞同時(shí)分析染色質(zhì)狀態(tài)/核小體定位、DNA甲基化、基因組拷貝數(shù)變異和染色體倍性倍性。并采用這一技術(shù)在單細(xì)胞分辨率上系統(tǒng)、深入地解析了小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中表觀基因組重編程的關(guān)鍵特征，以及染色質(zhì)狀態(tài)與DNA甲基化之間的互動(dòng)關(guān)系。這是一次在單細(xì)胞內(nèi)對(duì)同一個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行多達(dá)5個(gè)層面的基因組和表觀基因組特征的分析，突出了DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)的不同模式和功能。
 

      考慮到單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序技術(shù)的相對(duì)低的覆蓋率，理想的狀態(tài)是明確地區(qū)分染色質(zhì)狀態(tài)，包括閉合狀態(tài)和未檢出的狀態(tài)。scCOOL-seq這一新技術(shù)是可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的單細(xì)胞染色質(zhì)測(cè)序方法。此外，scCOOL-seq可以同時(shí)檢測(cè)同一個(gè)體細(xì)胞中染色質(zhì)狀態(tài)、核小體定位、內(nèi)源DNA甲基化、CNV倍性，這將大大增強(qiáng)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)不同遺傳和表觀遺傳層之間的復(fù)雜關(guān)系的分析能力，為今后人們繼續(xù)研究哺乳動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞全能性和多能性的開啟奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為體細(xì)胞克隆效率的提高以及早期胚胎發(fā)育異常的診斷與治療提供了新思路。

DroNC-seq

      10月，Broad研究所張鋒教授團(tuán)隊(duì)在Nature Methods上發(fā)表題為“Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq with DroNc-Seq (doi: 10.1038/nmeth.4407)” 的文章，提出了一個(gè)新的測(cè)序技術(shù)：DroNc-Seq單細(xì)胞表達(dá)譜分析技術(shù)。該技術(shù)混合了sNuc-Seq技術(shù)與微流控技術(shù)的單細(xì)胞核RNA測(cè)序方法，可以在結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織中更有效地分析大量細(xì)胞或細(xì)胞核中的RNA，開啟單細(xì)胞核測(cè)序的規(guī)模化時(shí)代。
   

      在利用單細(xì)胞技術(shù)來研究大腦等復(fù)雜組織的基因表達(dá)時(shí)，研究人員總會(huì)覺得困難重重，因?yàn)閺?fù)雜組織不易分離，難以辨別，分離細(xì)胞的過程會(huì)經(jīng)常破壞目的神經(jīng)元和RNA。sNuc-seq則利用單個(gè)提取的細(xì)胞核作為起始材料，通過觀察細(xì)胞核去理解不同的細(xì)胞類型和動(dòng)態(tài)過程，如神經(jīng)的形成。但sNuc-Seq是一種低通量的技術(shù)，其應(yīng)用規(guī)模受到了限制。為擴(kuò)大研究的應(yīng)用規(guī)模，實(shí)現(xiàn)一次可研究數(shù)千個(gè)細(xì)胞核的高效測(cè)序，研究團(tuán)隊(duì)將目光轉(zhuǎn)向了Drop-Seq。它將單細(xì)胞與帶有DNA條碼的微珠一起包裹在微滴中，大大加速表達(dá)譜分析實(shí)驗(yàn)，同時(shí)降低成本。他們開發(fā)出了混合了兩種技術(shù)的DroNc-Seq方法。為檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性與效率，研究人員利用DroNc-Seq對(duì)小鼠細(xì)胞系和腦組織進(jìn)行了分析，并與Drop-Seq、sNuc-Seq以及其他較低通量的單細(xì)胞RNA-Seq方法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示DroNc-Seq表現(xiàn)出了靈敏、高效且無偏向的細(xì)胞分類能力。該技術(shù)很可能用于人體細(xì)胞圖譜計(jì)劃項(xiàng)目。

SISSOR

      11月加州大學(xué)圣地亞哥分校張鹍教授團(tuán)隊(duì)在PNAS上發(fā)表題為“Ultra-accurate Genome Sequencing and Haplotyping of Single Human Cells (doi: 10.1073/pnas. 1707609114)”的文章。開發(fā)了一個(gè)名為“SISSOR” (微流體反應(yīng)器法單鏈測(cè)序)的方法，用來進(jìn)行準(zhǔn)確的單細(xì)胞基因組測(cè)序和單倍體分型。

      正常人類單個(gè)細(xì)胞DNA含量為6.6pg，相對(duì)于測(cè)序所需的ug級(jí)相當(dāng)微量，并且有些DNA是獨(dú)特的，因此單細(xì)胞測(cè)序的關(guān)鍵一環(huán)是全基因組擴(kuò)增(WGA)，常見的方法如，MDA、MALBAC等需要用DNA聚合酶對(duì)細(xì)胞基因組做大量的體外擴(kuò)增，然后構(gòu)建文庫進(jìn)行相對(duì)讀長較短的高通量測(cè)序。這些方法有兩個(gè)明顯的缺點(diǎn)：1，聚合酶的錯(cuò)誤擴(kuò)增可以在基因組上產(chǎn)生成千上萬的假陽性。2，短的序列讀長幾乎不包含任何單倍體類型信息。

      SISSOR方法是利用微流體處理器將單個(gè)細(xì)胞染色體DNA的正負(fù)雙鏈進(jìn)行分離，并將百萬堿基大小的DNA片段隨機(jī)分割成大量的納升級(jí)的組分，用于擴(kuò)增和構(gòu)建測(cè)序文庫，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)同源染色體的互補(bǔ)雙鏈分別進(jìn)行獨(dú)立的測(cè)序。這樣就能夠進(jìn)行Long-range單倍體的組裝，并且還能利用冗余和單倍體型信息糾正測(cè)序錯(cuò)誤。結(jié)果顯示，該方法的糾錯(cuò)能力可以將單細(xì)胞測(cè)序錯(cuò)誤率降低至10-8，并且單倍體片段平均可組裝長度為500 kb，contig達(dá)到N50大于7 Mb。該方法能夠準(zhǔn)確獲得單細(xì)胞基因組序列以及單倍體信息以滿足臨床對(duì)基因組測(cè)序的不同需求。SISSOR是對(duì)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的一次突破，將測(cè)序準(zhǔn)確性提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。這項(xiàng)技術(shù)潛在的應(yīng)用包括對(duì)患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)，以及對(duì)體外受精的健康胚胎進(jìn)行篩選和檢測(cè)經(jīng)過基因編輯的人體細(xì)胞。

snDrop-seq+scTHS-seq

       張鹍教授團(tuán)隊(duì)本月又在Nature Biotechnology雜志上發(fā)表了“Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain (doi: 10.1038/nbt.4038)”的文章。開發(fā)了基于冰凍組織高通量單細(xì)胞核測(cè)序方法來繪制成年人腦第二代單細(xì)胞圖譜，再次引爆了單細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。

      研究人員將視線聚焦于腦組織提取的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞核，克服了樣本的限制，使該方法可以應(yīng)用于新鮮或凍存的腦組織，實(shí)現(xiàn)了凍存組織的大規(guī)模單細(xì)胞檢測(cè)。另外，這項(xiàng)研究的一個(gè)創(chuàng)新之處在于結(jié)合了兩種高通量單細(xì)胞技術(shù)：基于微流體的單核測(cè)序 (snDrop-seq) 和單細(xì)胞轉(zhuǎn)座子超敏感位點(diǎn)測(cè)序 (scTHS-seq)的方法。snDrop-seq，不僅可以對(duì)成千上萬個(gè)單細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，從多方面對(duì)細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行分類，還可用于評(píng)估新鮮和凍存人體組織中的特異性表達(dá)譜，有助于研究組織的功能異質(zhì)性。該技術(shù)還攻克了在微滴中有效裂解核膜而不引起RNA過度降解的難題。為同時(shí)研究表觀遺傳特征，該團(tuán)隊(duì)還開發(fā)了scTHS-seq技術(shù)。scTHS-seq擁有具有體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的線性優(yōu)勢(shì)和改造后的突變Tn5轉(zhuǎn)座酶，比ATAC-seq靈敏度更高，還提高了高度細(xì)胞特異性的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子(distal enhancers)的覆蓋度。

      研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合應(yīng)用以上兩種方法建立了這種可并行檢測(cè)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄本和表觀遺傳特征的高通量測(cè)序平臺(tái)，為綜合分析凍存人體組織樣本中基因表達(dá)和調(diào)節(jié)提供了途徑。研究人員用此方法檢測(cè)了超過60,000個(gè)來自成人大腦皮層和小腦的單細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了35種不同的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞亞型。此外他們還將常見的人腦遺傳疾病相關(guān)的遺傳位點(diǎn)定位到特定的細(xì)胞類型，揭示了大腦中哪些細(xì)胞類型更易受腦部疾病遺傳因子的影響。這些發(fā)現(xiàn)有助于確定大腦中哪種類型的細(xì)胞容易受到遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子的攻擊，繪制了一個(gè)完整的人腦細(xì)胞圖譜。

TSCS

     本月，美國安德森癌癥中心的研究人員在Cell上發(fā)表”Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing (doi:10.1016/

j.cell.2017.12.007)” 的研究性文章，發(fā)明了一種新的“地形”單細(xì)胞測(cè)序技術(shù) (Topographic Single Cell Sequencing, TSCS)來研究細(xì)胞位置的空間信息，用于研究早期乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌 (DCIS)是如何發(fā)展為更具有侵襲性的導(dǎo)管癌癥 (IDC)。

     腫瘤細(xì)胞往往存在著各不相同的遺傳特征，這被稱為腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。它們獨(dú)特的細(xì)胞構(gòu)成使得治療變得更加困難。此前的單細(xì)胞DNA測(cè)序方法已經(jīng)打開了探索腫瘤細(xì)胞的大門，成為了理解腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的有力工具，但是這種方法能夠去除關(guān)于個(gè)體腫瘤細(xì)胞在組織內(nèi)準(zhǔn)確空間定位的信息。而細(xì)胞空間數(shù)據(jù)對(duì)于了解腫瘤細(xì)胞的遷移至關(guān)重要。研究人員開發(fā)的新工具：“地形”單細(xì)胞測(cè)序 (TSCS) ，該方法提供了有關(guān)細(xì)胞位置的空間信息，能更準(zhǔn)確地從空間上測(cè)量和描述單個(gè)腫瘤細(xì)胞的具體特征。這代表了一個(gè)技術(shù)上的里程碑，此前的技術(shù)只能采用失去了空間信息的懸浮細(xì)胞。
 

       研究人員利用TSCS對(duì)來自10位具有DCIS和IDC的患者的1293個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了分析。研究數(shù)據(jù)揭示了DCIS和IDC之間的直接基因組譜系，并進(jìn)一步指出了入侵之前，在導(dǎo)管內(nèi)發(fā)生的大多數(shù)突變和DNA拷貝數(shù)畸變。表明多個(gè)癌細(xì)胞克隆可以從導(dǎo)管共同遷移到相鄰區(qū)域，形成侵入性腫瘤。

       TSCS和其他類似的單細(xì)胞測(cè)序方法在開發(fā)早期癌癥研究新途徑方面具有巨大的潛力。希望這些研究未來能揭示為何一些惡性腫瘤前癌沒有發(fā)展成惡性腫瘤，而另外一些則形成了侵入形式。

       隨著前不久前“人類細(xì)胞圖譜”計(jì)劃的開展，單細(xì)胞測(cè)序的研究熱情必然持續(xù)高漲。這些單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的不斷更新和發(fā)展無疑為構(gòu)建完整細(xì)胞圖譜提供了技術(shù)基礎(chǔ)。我們可以預(yù)見，未來綜合多組學(xué)的方法必將在復(fù)雜器官和組織的單細(xì)胞研究中發(fā)揮愈發(fā)強(qiáng)大的作用。