1.研究背景
                   異質(zhì)細(xì)胞群體中的細(xì)胞多樣性能夠?qū)?xì)胞存活和增殖、對(duì)藥物療法和干預(yù)作出的反應(yīng)以及很多其他的生物過程產(chǎn)生深刻影響。高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可用來(lái)研究黑色素瘤組織多樣性的復(fù)雜細(xì)胞微環(huán)境。
2.方法流程
    ? 通過流式分選了來(lái)自于 19 個(gè)患者的 4,645 細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；每個(gè)細(xì)胞 15 萬(wàn)Reads 數(shù)。? 熒光免疫組化分析。
3.研究結(jié)果
    ? 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜區(qū)分惡性細(xì)胞和非惡性細(xì)胞的狀態(tài)
        通過 CNV 分析確定為惡性的細(xì)胞，然后根據(jù)其基因表達(dá)情況進(jìn)行了 TSNE 降維分析，惡性細(xì)胞分為 6 個(gè)亞型，表明了腫瘤的異質(zhì)性。而非惡性細(xì)胞則相反，主要是通過細(xì)胞類型進(jìn)行了區(qū)分，比如 T 細(xì)胞、 B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（ CAFs）和 NK 細(xì)胞（圖1）。

圖1 惡性細(xì)胞和非惡性細(xì)胞分群結(jié)果

   ? 惡性細(xì)胞的分析揭示了細(xì)胞周期的異質(zhì)性
       使用 G1 或 S／M 期的標(biāo)志性基因來(lái)分析惡性細(xì)胞的不同亞群（圖 2），該分析揭示了在腫瘤組織中，循環(huán)的細(xì)胞所占的比例平均為 13.5%；也區(qū)分低循環(huán)狀態(tài)的細(xì)胞和高循環(huán)狀態(tài)的細(xì)胞，比如 Mel79 處于低循環(huán)、而 Mel78 則處于高循環(huán)狀態(tài)的腫瘤。 KDM5B 基因的表達(dá)與非循環(huán)狀態(tài)的腫瘤有高度相關(guān)性，它在小鼠模型中編碼 H3K4 組蛋白去甲基酶，這個(gè)酶與低循環(huán)相關(guān)，同時(shí)也有類似于黑色素瘤干細(xì)胞的耐藥性的特征。

圖2細(xì)胞所處循環(huán)狀態(tài)展示圖

   ? 非惡性細(xì)胞以及他們?cè)诤谏亓鑫h(huán)境中的相互作用
       各種各樣的非惡性細(xì)胞組成了腫瘤的微環(huán)境，微環(huán)境的組成對(duì)腫瘤的發(fā)要影響。通過單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)區(qū)分了微環(huán)境中不同細(xì)胞的類型（圖 3），包括T細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞（ CAFs），并通過特征標(biāo)簽揭示了這些細(xì)胞在微環(huán)境中的相對(duì)豐富程度。

圖3 大量黑色素瘤細(xì)胞之間的數(shù)據(jù)拆分解揭示了細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用

   ? 腫瘤浸潤(rùn)性 T 淋巴細(xì)胞的多樣性及其功能狀態(tài)
       腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（ TILs），尤其是 CD8 + T 細(xì)胞是免疫監(jiān)視的主要決定因素。單細(xì)胞測(cè)序分析來(lái)推斷各種類型 T 細(xì)胞的功能，從而有助于研究對(duì)免疫檢查抑制劑的腫瘤反應(yīng)和抵抗（圖 4）：通過特征性標(biāo)記定義了 T 細(xì)胞的主要亞群，比如 CD4+,Tregs， CD8+等（圖 3A）。然后通過耗竭基因分析了細(xì)胞的耗竭狀態(tài)，并通過免疫組化驗(yàn)證（圖 4B 和 4C）。最后分析了細(xì)胞毒 T 細(xì)胞中耗竭 T 細(xì)胞的特征表達(dá)狀態(tài)，以及高耗竭和低耗竭細(xì)胞的基因表達(dá)情況（圖 4D、 E、 F），并進(jìn)行了 TCR 分析（圖 4G 和 H）。

圖 4 T 細(xì)胞耗竭特征基因的激活依賴和非激活依賴變異

    通過對(duì)黑色素瘤開展的大規(guī)模單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，系統(tǒng)研究了腫瘤內(nèi)的不同細(xì)胞亞群的組成、細(xì)胞亞群的功能以及腫瘤的微環(huán)境，為精準(zhǔn)免疫治療提供了參考。